Вчені Массачусетського технологічного інституту розробили новий інструмент редагування генів PASTE на основі технології CRISPR, який може вирізати дефектні гени цілком та замінювати їх більш ефективним та безпечним способом. Метод дозволяє впроваджувати у геноми гігантські фрагменти ДНК завдовжки кілька тисяч нуклеотидів. Про це повідомляється у статті, опублікованій у журналі Nature Biotechnology.
PASTE поєднує в собі технологію CRISPR-Cas9 та ферменти інтегрази. CRISPR-Cas9 є генетичними «ножицями», які спочатку використовувалися бактеріями у боротьбі з вірусами. Білок Cas9 розрізає подвійний ланцюжок на певній ділянці гена-мішені, що визначає гідова РНК (гРНК). Якщо поруч знаходиться окремий відрізок ДНК, він вбудовується в місце розрізу.
Недоліком CRISPR є те, що Cas9 виробляє дволанцюгові розриви, які можуть призводити до великих пошкоджень ДНК або навіть хромосомних перебудов, що спричиняють загибель клітини або її переродження в ракову. Іншим обмеженням є відсутність у клітинах, що не діляться, активованих механізмів репарації ДНК, необхідних для вбудовування потрібної ділянки гена. Щоб вирішити цю проблему, дослідники використовували великі серинові інтегрази – ферменти бактеріофагів, які вбудовують вірусні послідовності ДНК в геном клітини-господаря, а саме в специфічні сайти attB (від англ. attachment) завдовжки 30-50 нуклеотидів.
PASTE ґрунтується на методі праймованого редагування геному (англ. prime editing). Спочатку комплекс, що складається з гідової РНК (pegРНК) та Cas9, зв’язується з цільовою послідовністю ДНК, після чого модифікований Cas9, званий ніказою, робить одноланцюжковий розріз. Фермент зворотна транскриптаза використовує пов’язану з комплексом додаткову РНК-ланцюг як шаблон синтезу потрібного ДНК-фрагмента дома розрізу. Таким чином, вченим вдалося вбудувати сайт attB довжиною 46 пар підстав, таким чином впровадивши «посадковий майданчик» для серинової інтегрази, яка активна навіть у клітинах, що не діляться.
Дослідники продемонстрували інтеграцію послідовностей розміром до 36 тисяч основ у трьох лініях клітин людини, включаючи лімфобласти, первинні Т-клітини та первинні гепатоцити людини, що не діляться. Вони протестували систему доставки з 13 різними генами, вбудувавши в дев’ять різних місць у геномі. Імовірність успішної вставки становила 5-60 відсотків, при цьому метод дав дуже мало небажаних вставок.
В даний час автори вивчають можливість використання PASTE як можливий спосіб заміни дефектного гена, що викликає кістозний фіброз. Цей метод також може бути корисним для лікування захворювань крові, викликаних мутаціями, таких як гемофілія або хвороба Гентінгтона, неврологічних розладів, спричинених надлишком генних повторів.
Спасибо!
Теперь редакторы в курсе.